摘要：利用高效液相色谱（hplc）法测定高粱籽粒中阿魏酸、原儿茶醛和花青素的含量，比色法测定总酚、总黄酮、缩合单宁的含量;运用偏最小二乘法建立nir光谱与hplc法和比色法分析值之间的多元校正模型，预测高粱籽粒中主要酚类物质的含量。
1引言
酚类化合物是高粱籽中一种重要的次生代谢物质，主要有酚酸、类黄酮及缩合单宁（原花青素）[1]。高粱酚类物质不仅是一种优良的天然抗氧化剂[2]，还具有多种保健功能和药理作用[3,4]。酚类物质的常规定量检测方法有化学测定法和高压液相色谱法[5]。前者分析精度低，无法测定单一酚类物质含量;后者分析精度较高，但是分析过程复杂，速度较慢，且对样品有化学污染，无法满足生产过程中在线成分含量监控的要求。近红外光谱技术是一种快速无损的分析技术，可以在lmin内完成物质多组分的检测[6]。近红外光谱（nir）主要是有机分子的倍频与合频吸收光谱，物质分子中的ch，nh，oh和co等基团的基频振动的倍频与合频吸收在近红外区，因此近红外技术比较适合于分析与这些基团有直接或间接关系的成分[7]，其突出优点是分析速度快、精度高，稳定性好。高粱籽粒中多酚类物质都含有大量的oh，ch，oh，ch2，choh及coroh等官能团，在近红外光谱区有明显的吸收。通过化学计量学的方法建立高粱籽粒多酚类物质的近红外数学模型，可快速测定高粱籽粒中多酚类物质的含量、降低检测成本。高粱酚类物质近红外预测模型在高粱优质育种和品质分析中具有广泛的应用价值。本实验采用近红外光谱分析技术定量分析高粱籽粒中多酚类物质的含量，并建立了高粱中总酚、总黄酮、缩合单宁、阿魏酸、原儿茶醛、花青素等酚类物质含量的数学模型，分析精度较高。
2实验部分
2.1实验样品的收集与选择
实验材料为山西、辽宁、甘肃、新疆、天津、内蒙古等地的33个高粱品种、8个苏丹草品种及19个高粱苏丹草杂交品种。所收集材料遗传源广、不同材料间以及籽粒不同部位中单宁含量差异显著。对60份参试材料种子的不同部位，包括种皮、脱壳籽粒、胚乳、胚以及整粒种子分别进行取样，最终形成300份实验样品。样品经粉碎机（北京六一厂）粉碎，过0.18mm孔径筛，并经cyclotectm1093型旋风磨（foss公司）二次粉碎,装入自封袋,常温避光保存,待测。
2.2样品中6种酚类物质的测定
参照文献[8],采用folinciocalteu法测定总酚含量，并略加修改;缩合单宁的测定参照文献[9]的方法进行;总黄酮的测定参照文献[10]的方法并略作修改;使用shimadze10a型高效液相色谱分析阿魏酸、原儿茶醛和花青素含量，具体步骤参照文献[11，12]进行。
2.3样品的光谱测定
antaristmft2niranalyzer光谱测定仪器（美国thermonicolet公司）,漫反射积分球附件,旋转式石英样品杯（内径约5cm）。附带应用软件为:tqanalystv6,result2integration,result2operation。主要工作参数为:测量光谱范围4000～10000cm-1;扫描次数:64;分辨率:8cm-1;增益:2倍;数据形式:log（1/r）。图16个测定样品的原始光谱图
fig.1originalspectraofsixtestedsamples
采集光谱前仪器预热2h。取10～20g高粱籽粒不同部位粉碎样品盛于直径50mm的旋转样品池中,轻轻摇匀,使表面平整，在上述光谱条件下采集样品的吸收光谱。为消除样品粉碎粒度大小、均匀性不一致等因素对光谱的影响，每个样品重复扫描3次,每次均扫描背景,计算其平均光谱存于计算机内。图1为所测定的6个样品的傅里叶变换近红外漫反射光谱图。
2.4模型的建立与验证
取280份粉碎样品组成校正集，另取20份粉碎样品作为验证集，在适宜的光谱预处理基础上，运用偏最小二乘法（pls）建立nir光谱多元校正模型。本实验结合多元散射校正（multiplicativescattercorrection,msc）和导数光谱（derivativespectra）对nir光谱进行预处理，用以消除光谱散射效应和基线飘移，通过比较不同波数范围和光谱预处理方法对模型的影响，确立没食子单宁、原花青素、原儿茶醛、缩合单宁、总黄酮和总酚含量nir多元校正模型的建模参数，模型初步建立后，通过tqanalyst提供的leverage诊断功能剔除奇异点，应用交叉验证法对模型逐步优化，进而确定建模的主因子数，并以相关系数（r）、内部交叉验证均方差（rmsecv）和校正/预测均方差（rmsec/rmsep）作为定量分析模型性能评价指标，同时用rsec和rsep来考察模型校正和预测的相对偏差。
3结果与讨论
3.1样品的选择及其化学分析结果
本实验选择了国内广泛种植的高粱品种、品系共60个,通过种子不同部位取样，最终形成300份样品，符合所提出的样品数为50个的要求[13]。表1为仪器测定方法（hplc法和uv法）所得的6种酚类物质在校正集样品和检验集样品中的分布情况。表1高粱籽样品中6类酚类物质含量测定情况（mg/g）
3.2模型的优化
3.2.1光谱波段的选择建模波段过宽，必然包含大量冗余信息，且各成分分子结构存在差异，使得各自对应的建模波段并不相同。因此，波段的选择有利于提高模型预测精度。本研究以r和rmsecv值作为评价指标（r值越接近1，rmsecv值越小越优）对建模波段进行优化，确定6种酚类物质各自建模波段，结果见表2。表2nir光谱建模波段
wavenumberrange（cm-1）总酚totalphenol9570.4～4131.0总黄酮totalflavone10000～7501.5缩合单宁proanthocyanidins6000.6～5200.0阿魏酸ferulicacid9003.1～4243.0原儿茶醛protocatechuicaldehyde9716.1～6001.8花青素anthocyanins7007.4～6003.33.2.2光谱数据预处理实现近红外光谱分析的前提是采用化学计量学方法建立光谱特征与待测组分之间的关系。高粱籽粉碎样品近红外光谱在4000～10000cm-1谱区内有信息含量丰富的吸收，导致其分析难度相当大。因此，需采用不同的光谱进预处理方法来消除近红外漫反射光谱中的随机误差和某些系统误差[14]。
在确定建模波段的基础上，以r和rmsecv为评价指标，比较nirs常用的预处理方法，如多元散射校正（msc）、标准正态变量校正（snv）、导数光谱（derivative）以及2种处理方法相结合的方法对模型的影响，结果见表3。由表3可知，对同一组建模样品集所有待测成分，采用不同的光谱预处理方法结果均比未进行光谱处理的结果好，但不同的光谱预处理方法之间存在一定的差别，说明不同的光谱预处理方法对模型的精度有一定的影响。对6个测定组分，用单一光谱预处理方法所得模型的r和rmsecv值的差异均较大，预测效果均不够理想;而用多元散射校正与导数光谱法相结合或标准正态变量校正与导数光谱法相结合的方法，r和rmsecv值均得到显著改善。以多元散射校正与二阶导数光谱法相结合的方法为，所得模型的误差较小，故最终确立以多元散射校正与二阶导数光谱法相结合作为预处理方法。表3不同的光谱预处理方法对近红外模型的影响
3.2.3建模主因子数确定建立多元校正模型需确定主因子数。主因子数太少将导致模型引入的信息量不足，未能充分反应被测组分产生的光谱变化，使模型预测准确度降低，出现模型“欠拟合”现象;而主因子数过多，又会将一些代表噪音的主成分加到模型中，出现模型“过拟合”，同样导致模型预测能力下降[15,16]。本实验确定的总酚、总黄酮、缩合单宁、阿魏酸、原儿茶醛和花青素6个测定成分建模主因子数分别为4，8，6，6，5和4。
3.3高粱籽中多酚类物质近红外数学模型的外部验证
随机抽取20份已知6种酚类物质含量的粉碎样品，组成检验集。用已建立的近红外数学模型进行外部检验，将预测值与uv测定值和hplc分析值进行比较，并绘出对应关系图，结果见图2～图4和表4。nir光谱预测值与uv测定值和hplc分析值之间相关性良好，6种酚类物质的nir光谱校正模型相关系数r均大于0.97，rsep控制在8%以内，预测回收率在～106%之间。以上数据说明用近红外数学模型预测的准确度接近其它仪器分析方法，并能够满足酚类物质生产过程实时分析的精度要求。校正模型确立后，nir光谱完成1次测量只需30s（扫描32次），可显著提高分析效率。
4结论
利用傅里叶变换近红外透射光谱和偏最小二乘法，建立了同时测定高粱籽粒中6种酚类物质的方法。校正集样本的回归和预测集样本的验证结果表明，用近红外光谱同时测定高粱籽粒中多种酚类物质的方法是可行的，结果准确。本方法适用于高粱等谷物籽粒多种酚类物质同时快速准确分析。后续工作应大量收集具有酚类化合物含量代表性的高粱样品，以保证模型的稳定性和可靠性。
结果表明，各成分近红外预测值与实测值之间的校正模型相关系数（r）、内部交叉验证均方差（rmsecv）、主因子数分别为：总酚0.9737，0.288，4;总黄酮0.9660，0.00671，8;缩合单宁0.9558，0.0289，6;阿魏酸0.9818，0.0391，6;原儿茶醛0.9979，0.0118，5;花青素0.9977，0.0523，4;预测相对偏差（rsep）分别为：总酚6.99%、总黄酮4.54%、缩合单宁7.13%、阿魏酸2.68%、原儿茶醛5.46%、花青素5.81%。结果表明，模型对样品nir的预测值与其相应的化学值有较好的相关性，此模型可用来预测高粱籽粒中的各酚类物质的含量，在高粱优质育种和品质分析中具有广泛的应用价值。